Prueba molecular para Galactosemia

El gen asociado a la galactosemia clásica es el GALT, pero este locus presenta más de 130 posibles mutaciones causantes de la enfermedad. En la población caucásica predominan dos mutaciones Q188R y K285N) que están presentes en más del 70% de los casos, mientras que en la población negra existe un principal alelo (S135L) que es responsable del 62% de los casos. Estrictamente, la mayoría de los individuos enfermos son en realidad heterocigotos compuestos en lugar de verdaderos homocigotos, porque poseen dos alelos del gen con diferentes mutaciones. Tanto para la galactosemia clásica como para sus variantes, se pueden llevar a cabo tres tipos de prueba.

Análisis dirigido de las mutaciones implicadas más comúnmente.

1. Análisis de secuencia del gen, que permite detectar SNPs, así como otras variaciones (microdeleciones e inserciones, mutaciones en los sitios de splicing).
2. Análisis de duplicación o deleción

 Para seleccionar la prueba molecular adecuada, se sigue un orden. En primer lugar, se confirma el diagnóstico molecular preliminar basado en síntomas con pruebas bioquímicas. Seguidamente, se realiza un análisis de mutaciones dirigido.

Enviar cualquiera de las siguientes opciones de acuerdo a la indicación del estudio:

• En pacientes con sospecha o diagnóstico de galactosemia clásica o en familiares con mutación identificada previamente:
• a) 3-5 ml. de sangre periférica con anticoagulante EDTA (tubo Vacutainer tapón lila o de biometría hemática), la muestra se puede conservar en refrigeración a 4ºC (NO CONGELAR), incluso por 5 a 7 días previo a su procesamiento.
•  b) Muestra de raspado de mucosa: con 2 a 3 cepillos estériles de citología o con un cepillo dental nuevo realizar de 20 a 30 raspados en carrillos y lengua, dejar secar a temperatura ambiente y enviar secos. La muestra se puede conservar a temperatura ambiente por 8 días previo a su procesamiento.

•  Para diagnóstico prenatal en familias en donde se haya identificado la mutación responsable en el gen GALT: Líquido amniótico (5ml), la muestra se puede conservar a temperatura ambiente por 3 días previo a su procesamiento.

TIEMPO DE ENTREGA: 2-3 semanas (diagnóstico prenatal en 5 a 7 días).

Bibliografía

http://ae3com.eu/protocolos/protocolo7.pdf
http://www.seqc.es/download/tema/6/2971/3022644/306382/cms/tema-10.galactosemia.pdf/
http://www.dnagen.com.mx/analisis-molecular-de-galactosemia-clasica/

Pruebas de Tamizaje y Confirmación en la Galactosemia

Amniocentesis.-

Esta es una prueba hecha durante el embarazo. Una aguja fina se utiliza para remover una pequeña cantidad de líquido del saco que rodea al feto. La muestra se puede utilizar para determinar ciertas enfermedades genéticas en el feto. La amniocentesis para diagnosticar condiciones genéticas se realiza usualmente entre las 13 y 20 semanas de embarazo.

Muestreo del Vello Coriónico (CVS).-

Esta es una prueba especial que se realiza temprano durante el embarazo. Durante un CVS, se toma una pequeña muestra de la placenta para hacer exámenes. Esta muestra se puede utilizar para determinar ciertas enfermedades genéticas en el feto. La CVS se lleva a cabo usualmente durante las 10 y 12 semanas de embarazo.

Otros exámenes.-

• Cuantificación de galactosa y galactotiol en plasma y en orina.
• La galactosuria debe identificarse con la reacción Clinitest para cuerpos reductores.
• Cribado neonatal se analiza galactosa y galactosa 1-fosfato en sangre seca del recién nacido mediante técnicas fluorimétricas y/o de tecnología de espectrometría de masas en tandem.
• Método cromatográfico en capa fina (primera micción de la mañana)

Beutler Test/Tamiz galactosa/Galactose screening.-

Sangre venosa: Generalmente se selecciona una vena del brazo.

Sangre capilar: Comúnmente los sitios para tomar muestras son las yemas de los dedos. En los bebés, la muestra se obtiene del talón. Una vez seleccionado el sitio, el médico puede colocar compresas calientes y asegurar el flujo de la sangre.

¿Cuáles son los resultados normales para éste examen?

Los resultados de las pruebas de laboratorio pueden variar dependiendo de la edad, género, historia clínica, el método usado para esta prueba y muchos otros factores. Si sus resultados son diferentes de los resultados sugeridos a continuación, esto no significa que usted tenga una enfermedad. Los siguientes resultados son considerados normales para estas pruebas:

• Neonatos:
  • Ensayo de inhibición: Crecimiento bacterial
  • Examen de Paigen: Ningún crecimiento bacterial
  • Ensayo fluorometrico cualitativo: Fluorescencia brillante a 1 y 2 horas
  • Ensayo fluorometrico cuantitativo: 18-30¹⁴⁹ micromol/horas/g Hgb (19-32 kilounidades/mol Hgb)

 Reacción en Cadena Polimerasa (PCR).-

Rango de referencia: 18,5 - 28,5 U/g Hgb

Recolección: Sangre total con EDTA o heparina

Volumen normal: 5 ml

Volumen pediátrico: 2 ml

Tiempo de análisis: 10 días

Almacenamiento: 14 días (T. ambiente) y 30 días (refrigerado)

Utilidad: Seguimiento de una prueba anormal de tamizaje de Galactosemia en recién nacidos. Test para chequear los parientes de un individuo afectado.

Limitaciones: Tienen una sensiblidad aproximada del 80% en la población Caucásica pero está reducido en otros grupos étnicos. La no detección de las dos mutaciones específicas en los genes de GALT no elimina la posibilidad de éste desórden, como también mutaciones raras GALT no detectadas por ésta prueba. Formas raras de galactosemia pueden ser causadas por la deficiencia de galactokinasa o galactosa-4-epimerasa. Las deficiencias de ésta enzima no son detectadas por ésta prueba.

 

 Bibliografía:  

http://www.lablasamericas.com.co/site/index.php/examen/galactosa_1__fosfato_uridil_transferasa/ 

https://ssl.adam.com/content.aspx?productId=52&pid=52&gid=250065&site=welldynerx.adam.com&login=well1815

Alteraciones en la traducción

En humanos, la deficiencia de GALT típicamente resulta de una mutación en el gen que codifica la enzima GALT. La mutación más común en seres humanos implica una mutación puntual en el residuo de aminoácido 188, haciendo que un residuo de glutamina se traduzca como un residuo de arginina. El desplazamiento de la glutamina, un aminoácido moderadamente hidrófilo, con arginina, un aminoácido básico cargado positivamente, da como resultado un cambio en la carga y por lo tanto la conformación enzimática sólo dos residuos lejos del sitio activo de la enzima, conduciendo a la inactividad de la enzima.

La mutación X380R, que rompe el codón de parada del gen GALT, provoca el alargamiento de la cadena proteica de la enzima GALT. 

Una supresión de cuatro nucleótidos en el extremo 5 ' Promotor, en una posición de 116 - 119 nucleótidos upstream del codón iniciador (5'UTR - 119delGTCA).

El ARN total y el ARNm de un sujeto heterocigoto X380R tiene los siguientes cebadores: RT4.1A (5 ' CCC AGT GAT CAT CCC CTT TTC 3 ') y 11B (5' TGC TAT ATC TGC CCA AAT TCC 3 ').

RT-PCR amplificado se añadió a una mezcla de PCR que contiene cebadores RT5.2APTT ( 5 'GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG ACC ACC ATG TCG GAT GTA ACG CTG CCA CT 3 ') y 11B (mencionadas anteriormente, situadas en la región 3'UTR muy próxima a la señal de poliadenilación). 

El producto T7-PCR anidado no purificado se usó para la reacción de transcripción / traducción in vitro con 35 S-metionina. Los productos de traducción se gelificación, calentaron, se separó en gel, se secó y la señal se detectó por autorradiografía.

Existen mutaciones en los exones 1-4, 6, 8-9 y 11 del gen GALT.

Se observaron patrones de banda anormales en los exones 2, 8 y 9. Después de la secuenciación de los exones 2 y 8, se produjeron nuevas mutaciones.
Fueron identificados: L74fsdelCT debido a la deleción de CT en el codón 74 y L256 / P257delGCC debido a la supresión de GCC en Codones 256 y 257. El análisis secuencial del exón 9 reveló la mutación K285N (AAG cambia por AAT)

Bibliografía

http://www.fnbrno.cz/data/files/IHOK%20-%20CMBGT/35%20-%20Hum%20Mut%202000%20GAL%20Kozak.pdf
http://digitalcommons.liberty.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1450&context=honors

Alteraciones en la transcripción

Clonación y expresión

Reichardt y Berg (1988) usaron secuencias peptídicas cortas conservadas entre E. coli y levadura para aislar un clon de ADNc de GALT humano. La proteína de 379 aminoácidos deducida tiene una masa molecular de aproximadamente 43 kD.

Transcripción de lectura a través de GALT / IL11RA

 Magrangeas (1998) estableció la existencia de elección de sitio poli (A) y fusion splicing de 2 genes adyacentes, codificando galactosa-1-fosfato uridililtransferasa y cadena alfa del receptor de interleucina-11 (IL11RA; 600939), en células humanas normales.

Esta unidad de transcripción de 16 kb contiene 2 promotores (el primero constitutivo, y el segundo, 8 kb "downstream", altamente regulado) y 2 señales de cleavage/poliadenilación separadas por 12 kb.

El promotor del gen GALT produce 2 mRNAs, un ARNm de 1,4 kb que codifica GALT y un ARNm de fusión de 3 kb cuando se empalma (splicing) el primer sitio poli (A) y se usa el segundo sitio poli (A). El mRNA de 3 kb codifica una proteína de fusión que contiene parte de la proteína GALT y la proteína IL11RA completa. El promotor GALT / IL11RA poli (A) transcripción resultados de una terminación con fugas y splicing alternativo.

Imagen de la locación de la mutación del gen GALT.

Bibliografía

http://omim.org/entry/606999

ADN recombinante en la naturaleza

Alteraciones en la epigenómica de la Galactosemia

La epigenética es un área de la genómica nutricional que estudia los cambios fenotípicos heredables que resultan de los cambios en la cromatina sin alterar la secuencia del DNA. Los mecanismos epigenéticos son modificaciones postraduccionales de las histonas (acetilación y desacetilación), metilación del DNA y los complejos de remodelaje ATP-dependientes. La alimentación se propone como uno de los mecanismos responsables de cambios epigenéticos. 

 

La evolución a largo plazo de la galactosémica clásica (GALT) sigue siendo poco alentadora. No está claro si las complicaciones resultan principalmente de la toxicidad prenatal/neonatal o de síntesis anormal de glicoproteínas y glicolípidos.

 

Se observaron perturbaciones significativas de múltiples vías de señalización celular:

• señalización de la proteín kinasa mitógeno-activada (MAPK), 
• la regulación del citoesqueleto de actina, 
• la adhesión focal y la 
• proteólisis mediada por ubiquitina. 

 Genes de la cohorte de GALT se ven alterados significativamente: SPARC (osteonectina) y S100A8 (S100 proteína ligadora de calcio). 

Incremento en niveles de estructuras galactosiladas y monogalactosiladas y una disminución en ciertas estructuras digalactosiladas. La glicosilación (IgG) anormalmente persistente de glicoproteínas séricas, observada con datos de microarray, indica una persistente dishomeostasis metabólica y disregulación génica en los GALT tratados.

La estricta restricción de la galactosa de la dieta claramente salva la vida en el período neonatal; pero la restricción estricta de galactosa a largo plazo puede contribuir a las anomalías sistémicas observadas.
 

 

Bibliografía:

http://www.medigraphic.com/pdfs/endoc/er-2013/er131d.pdf

http://www.guiametabolica.org/noticia/galactosemia-trastorno-monogenico-consecuencias-epigeneticas

 

Alteraciones de la replicación en la galactosemia

En 1961 dos microbiólogos franceses, Francois Jacob y Jacques Monod, descubrieron un mecanismo de regulación y control de síntesis de proteínas en bacterias al que dieron el nombre de operón.

Notaron que la bacteria Escherichia coli sintetizaba ciertas enzimas de manera constante, mientras que otras se sintetizaban en el momento en que eran requeridas. Es decir, si la bacteria era colocada en un medio que contenía lactosa (azúcar de la leche), ésta empezaba a producir las enzimas que la digieren en galactosa y glucosa; por el contrario, si el medio carecía de lactosa, la bacteria no la producía pues era inútil su producción. Jacob y Monod estudiaron la producción de tres enzimas que intervienen en la digestión de la lactosa: la beta-galactosidasa, la galactosa permeasa y la tiogalactósido transacetilasa. Por razones de nomenclatura decidieron llamarlas enzimas z, y y a, respectivamente. De igual forma designaron a los genes que las producían como los genes estructurales responsables de su síntesis (un gene estructural es aquel que codifica, es decir que tiene la información necesaria para la síntesis de una proteína o parte de ella)